不久之后，列奧納多又用紅粉筆畫了一幅草圖，后來這幅紅粉筆畫又被其他人用墨水描了一遍，該圖現(xiàn)存放在威尼斯學(xué)院美術(shù)館。該草圖顯得比較粗糙，很大程度上應(yīng)歸咎于墨汁的影響，不過《最后的晚餐》的均勻的布局在這幅草圖上已初顯端倪。眾門徒被分成了幾組，畫面更注重人物的個(gè)性特征。為了明確人物身份，人物形象下面出現(xiàn)了匆忙寫就的說明文字（其中菲利普被提到了兩次）。但猶大仍然在桌子的靠近觀者的一側(cè)，約翰依然睡得很沉。

這些素描讓我們看到了列奧納多關(guān)于此畫的早期想法。他迅速而聚精會(huì)神地做好微型藍(lán)圖，心中不停問自己——是這樣畫還是那樣畫？但正如列奧納多常會(huì)表現(xiàn)的那樣，他的繪畫基礎(chǔ)非常扎實(shí)，盡管這些素描是第一批真正為圣瑪利亞感恩教堂的《最后的晚餐》所作的習(xí)作，但我們?cè)谒乃孛璨局姓业搅肆硪粡埬甏绲募垙垼梢宰匪莸?5世紀(jì)80年代，上面畫著三幅互有關(guān)聯(lián)的素描：一群人坐在桌子旁邊，有一人單獨(dú)坐在桌前，雙手托著腦袋，還有一個(gè)人毫無疑問就是耶穌，他的手指指向那個(gè)命中注定的碟子。這三幅素描并不是為《最后的晚餐》所作的習(xí)作，因?yàn)楫嬛兄挥形鍌€(gè)人坐在桌旁愉快地聊天以打發(fā)時(shí)間，他們并不是耶穌的門徒。畫中場景可能是發(fā)生在某次鄉(xiāng)村的歡宴中，人們圍坐在桌前。但不知是什么激發(fā)了列奧納多的靈感，使他在同一頁紙上迅速畫下吃圣餐的基督這一令人心酸的場景，十五年之后這個(gè)想法終于在那幅偉大的米蘭壁畫中開花結(jié)果。

溫莎皇家圖書館和威尼斯藏有的素描的重心逐漸從整體布局轉(zhuǎn)移到單獨(dú)人物形象特征上面。溫莎皇家圖書館藏有著名的系列頭像，大多數(shù)用紅粉筆畫成，有一些已經(jīng)畫得比較完整。那些人物形象終于變得清晰起來：猶大、彼得、大雅各、圣菲利普（幾乎可以肯定，最后兩個(gè)形象用的是同一個(gè)模特，只不過在圖畫中被賦予了鮮明的個(gè)性特征）。其中有一幅圣約翰雙手的習(xí)作，畫面非常精美；還有一幅習(xí)作上畫著圣彼得的衣袖。“福斯特筆記本”中還有一些簡短的評(píng)論，對(duì)這些習(xí)作進(jìn)行了補(bǔ)充——某位來自帕爾馬的亞歷山大為耶穌的手提供原型；“住在比塔的克里斯托法諾·達(dá)·卡斯蒂廖內(nèi)的頭部的形狀很美”。其中有一處筆記，標(biāo)題非常簡單，就寫著“耶穌”兩字，列奧納多在下面寫著“摩塔洛紅衣主教手下的喬瓦尼·孔蒂”，這個(gè)人可能就是耶穌的模特。阿拉貢有位消息靈通人士名叫路易吉，他在1517年親眼見過《最后的晚餐》，據(jù)他記載，畫中的一些門徒是“米蘭朝臣和知名市民的真實(shí)肖像”。

在一個(gè)著名的片斷中，列奧納多列出了一些門徒聽到基督宣言后的各種反應(yīng)：

一個(gè)正在喝酒的門徒把酒杯放回原位，把頭扭向說話人。

一個(gè)扭動(dòng)手指的人，轉(zhuǎn)向他的同伴，表情十分嚴(yán)肅，展開雙臂，露出掌心，肩膀上聳，碰到了他的耳朵，驚訝地張大嘴巴……

一人轉(zhuǎn)過身，手里拿了一把刀子，碰倒了桌上的玻璃杯……

一個(gè)人身體前傾望著說話者，雙手遮住了自己的眼睛。

其中一些人物描寫在最后完成的壁畫中得到了體現(xiàn)，比如白胡子的圣安德魯（從左邊數(shù)第三個(gè)人）攤開他的掌心，聳起他的肩膀。而其他人的動(dòng)作都發(fā)生了改變，轉(zhuǎn)過身、手中拿把刀子的那個(gè)人變成了圣彼得，而碰倒玻璃杯的則變成了另一個(gè)人，他就是打翻鹽瓶的猶大。這些姿勢中至少有一個(gè)早已出現(xiàn)在溫莎皇家圖書館收藏的第一幅構(gòu)圖素描中，即人數(shù)較少的那組人像中，耶穌和猶大之間的那個(gè)人“用手遮住了眼睛”。

與整體構(gòu)圖一樣，這些帶有感情色彩的動(dòng)作體現(xiàn)了列奧納多《最后的晚餐》中嶄新的理念：他摒棄了從中世紀(jì)流傳下來的構(gòu)圖傳統(tǒng)，即信徒們沿著桌子呆板地坐成一條直線。在佛羅倫薩，列奧納多應(yīng)該看到過塔代奧·加迪、安德烈亞·德爾·卡斯塔尼奧、安吉利科修士和多梅尼科·吉蘭達(dá)約各自繪制的《最后的晚餐》。吉蘭達(dá)約是在萬圣修道院餐廳繪制的《最后的晚餐》，壁畫優(yōu)雅精致，但缺乏活力，該壁畫完成不久列奧納多才前往米蘭。在列奧納多《最后的晚餐》中，用餐者的線條被打斷了，取得了神奇的效果。呈現(xiàn)在我們眼前的是波浪狀的一群人，彼得羅·馬拉尼把這種波浪形看做是“巴黎手稿C”中的光學(xué)圖示。門徒們被分成四個(gè)組，每組三個(gè)信徒：聚集成群的這些信徒突然處在了一個(gè)緊要關(guān)頭。列奧納多也找到了他戲劇性的一刻：不是圣餐儀式，也不是確認(rèn)猶大的身份，而是眾人在聽到耶穌宣布消息時(shí)極度震驚的反應(yīng)——“只有在你們面前我才能肯定地說，你們中間有人將要背叛我。”眾信徒悲痛萬分。（《馬太福音》26:21－2）因而，畫面布局的流暢部分是由基督的這個(gè)決定造成的，即講故事的那一刻出現(xiàn)的，幾乎就是電影中的一幕。盧卡·帕喬利是最早對(duì)這幅壁畫作出評(píng)論的人之一，他對(duì)這一點(diǎn)有過絕佳的詮釋。1498年12月14日，他在為自己著的《神圣的比例》一書寫的獻(xiàn)辭中說道：

在眾門徒聽到那個(gè)聲音說出“有人背叛了我”的時(shí)候，我們很難想像他們當(dāng)時(shí)的表情專注到什么程度。通過行為和手勢，門徒們似乎在互相對(duì)話，一個(gè)人跟另一個(gè)人說，而那個(gè)人又跟旁邊另一個(gè)人講，都顯得驚訝不已。就這樣，我們的列奧納多用他那巧奪天工之手創(chuàng)造了這戲劇性的一刻。